Inactivation of spores an vegetative cells of the bacterium Alicyclobacillus acidoterrestris using atmospheric cold plasma

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Volltext

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Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften Masterstudiengang Lebensmittel- und Bioprodukttechnologie

Master-Arbeit

Inaktivierung von Sporen und

vegetativen Zellen des Bakteriums

Alicyclobacillus acidoterrestris mit Hilfe

von atmosphärischem Kaltplasma

URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis2015-0048-7

vorgelegt von: Anne Joppa

Erstprüfer: Prof. Dr. Steffens Zweitprüfer: Prof. Dr. Garbe

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Abstract

The aim of this master thesis was to prove an inactivation of vegetative cells and spores of the bacteria Alicyclobacillus acidoterrestris due to the use of atmospheric cold plasma treatment. The germ has been given into a fluid medium as well as onto a plastic surface (Petri dish) and onto a grapefruit pericarp followed by the regarded treatment.

In doing so the test results displayed an inactivating effect of the issued procedure to the bacteria. Differences between varying surrounding medias occurred. Whereas the liquid inoculation showed a low mortification of 0.9 logs, the bactericidal effect of the cold plasma on the grapefruit pericarp and the Petri dish was much stronger. The inhibition on the plastic surface also showed in opposite to the grapefruit a superiority by 1 log unit. This effect has been observed at the trial regarding the vegetative cells as well as the trial on spores. An inactivation rate of 4.2 logs during the longest application time has been reached. This suggests, the duration of the treatment is crucial to the extent of the inactivation. A fundamental difference between the inhibition of vegetative cells and spores due to the treatment has not been observed.

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Abkürzungs- und Symbolverzeichnis

Abkürzung Bedeutung

A. a. Alicyclobacillus acidoterrestris

aW-Wert „activity of water“ = Wasseraktivität

DBD „dielectric barrier discharge“ = dielektrisch behinderte Entladungen (DBE) KbE Koloniebildende Einheit(en)

MW Mittelwert

pH-Wert negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration ppb „parts per billion“ = 1 Milliardstel (10-9)

ppm „parts per million“ = 1 Millionstel (10-6)

Sp. Sporen ssp. Subspezies St.-abw. Standardabweichung veg. vegetativ v.Z. vegetative Zellen YSG-Agar Hefeextrakt-Stärke-Glucose-Agar

Formelzeichen Erklärung Einheit

c Konzentration g/l E Elektronenvolt eV g Erdbeschleunigung m/s2 L Länge m, cm, mm Λ Wellenlänge nm m Masse g n Drehzahl U/min t Zeit s, min, h, d T Temperatur °C V Volumen μl, ml, l Ø Durchmesser cm

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 6

2 Stand der Wissenschaft und Technik ... 8

2.1 Alicyclobacillus acidoterrestris ... 8

2.1.1 Auftreten ... 8

2.1.2 Beschreibung ... 8

2.1.3 Reaktionsprodukte von A. a. ... 9

2.1.4 Sporen ... 11

2.1.4.1 Ursache der Sporenbildung ... 11

2.1.4.2 Bildung ... 12 2.1.4.3 Auskeimung ... 13 2.1.4.4 Resistenz ... 14 2.1.5 Dekontaminationsverfahren ... 15 2.3 Kaltplasma im Lebensmittelbereich ... 16 2.3.1 Definition ... 16

2.3.2 Einteilung nach der Positionierung des Lebensmittels ... 18

2.3.3 Funktionsweise der Inaktivierung von Mikroorganismen ... 20

2.3.4 Einfluss auf Lebensmittel ... 21

2.3.5 Anwendung im Lebensmittelbereich ... 21

2.4 Zitrusfrüchte ... 23

3 Material und Methoden ... 24

3.1 Verwendete Mikroorganismen und Materialien... 24

3.2 Geräte ... 25

3.3 Vorbereitung der Versuche ... 25

3.4 Vorbereitung des Oberflächenplasmageräts ... 26

3.5 Durchführung der Versuche ... 27

3.5.1 Vorversuche ... 27

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3.5.3 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Kunststoffoberfläche (Petrischale) ... 29

3.5.4 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale... 31

3.5.5 Vergleich der Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale mit der Behandlung mit UV-Strahlen ... 32

3.5.6 Statistische Auswertung ... 33

4 Ergebnisse ... 34

4.1 Vorversuche ... 34

4.2 Plasmabehandlung von A. a. in einer Flüssigkeit ... 36

4.3 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Kunststoffoberfläche (Petrischale) ... 37

4.4 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale... 42

4.5 Vergleich der Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale mit der Behandlung mit UV-Strahlen ... 46

5 Diskussion ... 49

6 Zusammenfassung ... 52

7 Literaturverzeichnis ... 53

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis ... 59

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6 1 Einleitung

Eine Kernfrage der Gegenwart ist die Gewährleistung der Ernährung für eine stetig wachsende Weltbevölkerung und damit verbunden die Verhinderung des vorzeitigen Verderbs vorhandener Lebensmittel. Auf dem Weltmarkt steht eine Vielzahl von Obst zur Verfügung. Dieses reicht von einheimischen Früchten wie Äpfeln, Birnen oder Blaubeeren bis exotischen wie Bananen, Kiwis oder auch Orangen und Grapefruits. Allen gemein ist, wie auch bei anderen natürlichen Produkten, dass Mikroorganismen auf diesen vorkommen. Dabei gibt es neben Schimmelpilzen und Hefen, die die Hauptverursacher für mikrobiellen Verderb auf Früchten darstellen, auch einige Bakterien, die bei der Obstverarbeitung eine größere Rolle spielen (Müller, 1997; Innerhofer, 2005). Dazu zählen neben Essigsäure-, Milchsäure- und Buttersäurebakterien auch die Bakterien der Gattung Alicyclobacillus. Diese Mikroorganismen sind zwar nicht pathogen, allerdings verursachen sie beispielsweise in der Getränkeindustrie jährlich einen Schaden in Millionenhöhe, indem sie einen Stoff produzieren, das sogenannte Guajacol, der die Sensorik beeinträchtigt und somit das Produkt letztendlich nicht mehr verzehrfähig macht. Die Art Alicyclobacillus acidoterrestris hat dabei die größte Bedeutung. In der Lebensmittelindustrie ist es daher wichtig, möglichst Produkte herzustellen, die nur wenige solcher Mikroorganismen enthalten bzw. frei von diesen sind. Allerdings ist dieses Bakterium nur schwer abzutöten, da es sowohl hitzeresistent, acidophil als auch sporenbildend ist. Gerade bei der Herstellung von Säften wie z.B. Orangensaft, wo dieser Keim vermehrt auftritt, stellt sich die Frage wie dieser Mikroorganismus inaktiviert oder entfernt werden kann. Weder eine längere Pasteurisation noch das saure Milieu hindern den Keim am Wachstum und an der Produktion von Guajacol. (Tianli et al., 2012; Clotteau, 2014) So ist ein Ansatz, den Mikroorganismus vor der Weiterverarbeitung zu inaktivieren. Dazu existieren schon mehrere Verfahren, die allerdings aus unterschiedlichen Gründen nicht optimal sind. Beispielsweise werden Verfahren wie γ-Strahlen, die zu einer schnellen nicht thermischen Dekontamination beitragen, aufgrund fehlender gesetzlicher Regelungen und geringer Verbraucherakzeptanz nicht eingesetzt (Reineke, 2013). Methoden, die UV-Strahlung beinhalten, beschädigen bei höheren Dosen das Lebensmittel. Desinfektionsflüssigkeiten wie Chlor oder Wasserstoffperoxid kommen aufgrund ihrer Aggressivität und Gesundheitsgefahr für den Anwender durch entstehende Dämpfe auch eher selten in Frage. (Clotteau, 2014; Beer, 2009) Eine Möglichkeit jedoch, die noch nicht lange verfolgt wird, ist die Anwendung von Plasmen zur Verringerung bzw. Inhibierung von Mikroorganismen. Dabei ist vor allem Kaltplasma interessant, da das Rohmaterial bei geringen Temperaturen damit behandelt werden kann. Bei

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verschiedensten Früchten bzw. Oberflächen wurde dieses bereits angewandt und zeigte Erfolge in der Hemmung.

Deswegen sollen in dieser Arbeit Versuche unternommen werden, die vegetativen Zellen bzw. die Sporen von Alicyclobacillus acidoterrestris mit atmosphärischen Kaltplasma abzutöten bzw. zu inaktivieren. Dabei sollen sowohl Experimente durchgeführt werden, wo der Keim in einer Flüssigkeit vorliegt als auch auf zwei verschiedenen Oberflächen fixiert ist. Das Bakterium A. a. soll im verbrauchten Nährmedium auf einer Kunststoffoberfläche (Petrischale) und auf einer Grapefruitschale inaktiviert werden.

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8 2 Stand der Wissenschaft und Technik 2.1 Alicyclobacillus acidoterrestris 2.1.1 Auftreten

Das Bakterium Alicyclobacillus acidoterrestris wurde erstmals 1982 in Deutschland als Ursache für einen großflächigen Verderb von Apfelsäften nachgewiesen. (Cerny et al., 1984) Die Kontaminationsquelle ist der Boden. Der Keim kommt auf sehr vielen verschiedenen Früchten wie Äpfeln, Orangen, Bananen, Wassermelonen, Grapefruits, Blaubeeren sowie Zitronen vor. (Takahashi et al., 2007; Tianli et al., 2014) Somit ist er bei unterschiedlichen Produkten wie Säften, Saftmischungen, -konzentraten, kohlensäurehaltigen Fruchtgetränken und haltbaren Eistees zu finden. (Clotteau, 2014)

Vielfältige Untersuchungen zum Vorkommen dieses Keims wurden daraufhin unternommen. In einer Studie der AIJN (European Fruit Juice Association) im Jahr 2005 stellte sich heraus, dass bei 45 % der 68 untersuchten industriellen Früchteverarbeiter Alicyclobacillus bereits mindestens einmal als Verderbniskeim auftrat. (Tianli et al., 2014) Bei einer anderen Befragung zeigte sich das sogar bei 60 % von 57 Firmen, wovon 35 % speziell auf Alicyclobacillus acidoterrestris zurückzuführen war. (Lee et al., 2002) Prinzipiell sind dabei bestimmte Produkte anfälliger als andere. Bei einer Analyse wurden verschiedene Risikoniveaus für die Kontamination ermittelt. Laut Clotteau (2014) sind Fruchtkonzentrate (Orange, Mango, Kokosnuss, Ananas) 8 % gefährdet, Fruchtsäfte für die Vermischung 9 bis 42,1 %, Orangensäfte 14,7 %, frische Saftprodukte 32 %, Apfelsaftkonzentrate 30,5 bis 75 %, und Orangensaftkonzentrate 82,1 %. Insgesamt gibt es allerdings kaum Statistiken, die sich mit den finanziellen Schäden dieses Keims direkt auseinandersetzen. Bei einer Berechnung aus den USA von Kang (2006) entstanden durch Alicyclobacillus spp. 0,41 Millionen US-Dollar Schaden allein im Bundesstaat Washington. Schließlich ist hieraus ersichtlich, dass dieser Keim in der Industrie auf jeden Fall Beachtung geschenkt werden sollte.

2.1.2 Beschreibung

Alicyclobacillus acidoterrestris ist ein gram-positives Stäbchen. Vegetative Zellen können zwischen 2,9 bis 4,3 μm lang und 0,6 bis 0,8 μm breit werden. Zudem lebt der Mikroorganismus obligatorisch aerob. Bei ungünstigen Umweltbedingungen bildet es Endosporen aus. (Wisotzjsey et al., 1992) Es ist frei beweglich und Katalase-positiv. Sein Gehalt an Cytosin und Guanin liegt bei 51,6 bis 53,3 %. Der aw-Wert für das Wachstum des Mikroorganismus sollte

über 0,984 liegen. Optimal sind 0,992. (Bevilacqua et al., 2008b) Der Temperaturbereich, indem das Bakterium überleben kann, liegt im Bereich von 20 bis 70 °C, sein pH-Bereich bei

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2,2 bis 5,8, wobei eine Temperatur von 40 bis 45 °C und ein pH-Wert von 4,0 bis 4,5 optimal sind. (Tianli et al., 2014; Bevilacqua et al., 2008b) Alicyclobacillus acidoterrestris gehört somit zu den thermo- und acidophilen Keimen. Gegenüber NaCl ist es relativ tolerant. Erst bei der Anwesenheit von 5 % NaCl ist der Organismus nicht mehr in der Lage zu wachsen. (Wisotzjsey et al., 1992) Für seinen Stoffwechsel kann er verwenden: Glucose, Erythritol, Ribose, D-Xylose, D-Fructose, D-Mannose, Rhamnose, Glycerol, D-Galctose, L-Arabinose, Inositol, Mannitol, D-Sorbitol, Arbutin, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Xylitol, D-Arabitol und Gentiobiose. (Tsuruoka et. al., 2003)

Der Name dieses Keims stammt dabei von den verschiedenen ω-Cyclohexan-Fettsäuren, die in der Zellmembran dieses Bakteriums eingelagert sind. Auf diese ist auch die extreme Säure- und Temperaturresistenz zurückzuführen. Sie ermöglichen eine kompakte und stabile Struktur der Membranlipide. (Kannenberg et al., 1984) Die konkrete Zusammensetzung der Fettsäuren ist: 65,1 % ω-Cyclohexan-C17:0, 24,0 % ω-Cyclohexan-C19:0, 4,1 % 17:0 anteiso, 2,5 % 17:0 iso, 2,5 % 16:0 und Spuren von 15:0 iso und 15:0 anteiso. (Tsuruoka et al., 2003)

Für die Kultivierung oder Isolierung von A. acidoterrestris wurden unterschiedliche Untersuchungen durchgeführt. Walls und Chuyate (2000) testeten Nährmedien wie Orangen-Serum-Agar (OSA) oder K-Agar auf ihren möglichen Einsatz. Dabei stellte sich K-Agar als am besten geeignetstes Medium für die Isolation von Sporen heraus. Überdies gibt es weitere Medien, die für A. a. geeignet sind: angesäuerter Kartoffel-Dextrose-Agar (APDA), Hefeextrakt-Stärke-Glucose-Agar (YSG), Hiraishi-Glucose-Hefeextrakt-Agar (HGYE), B. acidoterrestris thermophiles Medium B. acidocaldarius Medium (BAT-BAM), Alicyclobacillus Medium (ALI), A. acidoterrestris Medium (AAM), SK-Agar und angesäuerter Malzextrakt Agar (MEA). (Bevilacqua et al., 2008b) YSG-Agar entspricht dabei der IFU (Internationale Fruchtsaft Union)-Standard Methode Nr. 12 für den Nachweis von Verderb produzierenden Organismen in Fruchtsäften. (Yokota et al., 2007) Beim Wachstum dieses Bakteriums auf Agar sind die Kolonien rundlich, cremefarben und teilweise transparent. Innerhalb von 6 Tagen bei einem pH-Wert von 4,0 und einer Temperatur von 50 °C können sie je nach Eignung des Mediums 3 bis 5 mm im Durchmesser betragen. (Wisotzjsey et al., 1992)

2.1.3 Reaktionsprodukte von A. a.

Alicyclobacillus acidoterrestris ist ein nicht pathogener Mikroorganismus. Bei Tests mit A. a. an Mäusen und Meerschweinchen kam es zu keinerlei Beeinträchtigung. (Walls; Chuyate, 2000) Das wesentliche Problem mit diesem Keim ist die Produktion von geschmacks- und geruchsverändernden Bestandteilen. Bei sensorischen Verkostungen wurde der Geschmack

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bzw. Geruch der verdorbenen Produkte als medizinisch, phenolisch, desinfektionsmittelartig oder rauchig beschrieben. (Clotteau, 2014). Die Haupt-Off-Flavors sind Guajacol (2-methoxyphenol) und Halophenole (2,6-dibromophenol und 2,6-dichlorophenol). Bei deren Produktion entstehen allerdings keine Gase, sodass ein Verderb rein äußerlich nicht sichtbar ist. Nur manche Lebensmittel zeigen dabei Sedimente, Trübungen oder Farbveränderungen. Sensorisch wahrnehmbar ist Guajacol schon bei sehr geringen Mengen. Untersuchungen zeigten, dass bereits 0,01 bis 40 ppb reichten, um den Geruch und Geschmack erkennbar zu verändern. Guajacol wird mit Zwischenschritten aus der organischen Verbindung Ferulasäure, 4-vinylguajacol, Vanillinsäure oder direkt aus Vanillin durch den Keim gebildet. Nicht gänzlich geklärt ist eine mögliche Entstehung von Guajacol aus Tyrosin. (Tianli et al., 2014)

Die Erzeugung der Stoffe Guajacol und Halophenole wird dabei durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst. Dazu zählen vor allem der Ausgangsstoff des Saftes, die Zellkonzentration, die Temperatur und die Hitzeschockanwendung. Dabei tritt bei Apfel- und Orangensäften am häufigsten ein Verderb auf, während manche andere Säfte für das Überleben von Alicyclobacillus ungeeignet sind. Die Konzentration an Zellen muss etwa 104-105 KbE/ml

betragen, bevor eine Produktion eintritt. Zudem ist eine stärkere Zunahme der Verderbnis auslösenden Stoffe bei höheren Temperaturen in bestimmten Bereichen zu finden. (Tianli et al., 2014; Clotteau, 2014) Laut Goto et al. (2008) waren manche Stämme von Alicyclobacillus acidoterrestris bei 45 °C schon nach 5 h in der Lage, über 40 ppm Guajacol herzustellen. Pettipher et al. (1997) stellte eine Produktion auch bei einer niedrigeren Temperatur von 25 °C fest. Nach 6 Tagen waren 14,1 ppb Guajacol bei einer Zellkonzentration von 6∙105 KbE/ml im

Orangensaft vorhanden, im Apfelsaft nach 10 Tagen 11,6 ppb bei einer Keimzahl von 2∙107

KbE/ml. Schließlich spielt auch eine Hitzeschockanwendung, wie diese bei der Pasteurisation eintritt, eine entscheidende Rolle. Dabei werden die Endosporen angeregt, wieder auszukeimen, und tragen so zur Erhöhung der Keimzahl und zur Produktion von Guajacol bei. (Tianli et al., 2014; Clotteau, 2014) Mittlerweile stehen chemische Verfahren wie auch Nachweiskits zur Verfügung, um diese Verbindung qualitativ oder auch quantitativ zu bestimmen. Dazu werden sowohl Extraktions- als auch chromatografische Verfahren wie z.B. Festphasenextraktion oder Hochleistungsflüssigkeitschromatografie eingesetzt. (Tianli et al., 2014)

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11 2.1.4 Sporen

2.1.4.1 Ursache der Sporenbildung

Sporen, sogenannte Endosporen, sind stoffwechselinaktive Dauerformen. (Unden, 2014) Erkennbar sind sie anhand typischer Merkmale wie ein extrem geringer Wassergehalt, keinerlei nachweisbare Stoffwechselaktivität und Vorkommen der Verbindung Dipicolinsäure. (Cypionka, 2010) Zur Bildung der Sporen kommt es, wenn ein Nährstoffmangel induziert wird. Sinken wachstumslimitierende Faktoren wie zum Beispiel Glucose unter einen kritischen Wert, dann werden etwa 200 Gene für den Sporulationsprozess aktiv. Es erfolgt eine differentielle Genexpression, bei denen die Gene der vegetativen Zellen wiederum inaktiv werden. (Fritsche, 2002) Der letztendliche Impuls der Zelle zur Sporulation entsteht dabei durch verschiedene zelluläre und extrazelluläre Faktoren und Reize, die durch eine mehrstufige Phosphorylierungskaskade ausgelöst und durch einen sogenannten Phosphatschalter wahrgenommen werden. Dabei sind z.B. Energie- und Redoxstatus oder der Zellzyklus solche Faktoren. Sie regulieren die Aktivität von vier Sensorkinasen (KinA-KinD), die wiederum auf drei bestimmte Phosphoproteine mit Asp- oder His-Resten durch Phosphorylierung auf verschiedenen Ebenen einwirken. Ein hoher ATP-Gehalt (als Kennzeichen für gute Energieversorgung) oder eine aktive Chromosomenreplikation (als Merkmal für vegetatives Wachstum) hemmen die Kinasen direkt oder indirekt. Zudem existiert ein Phosphorelay, welches durch Phosphatasen in Abhängigkeit von zellulären Reizen dephosphoryliert und damit inaktiviert wird. Diese wirken im Zusammenspiel auf das Schalterprotein Spo0A ein. Bei ausreichender Phosphorylierung des Proteins ist die Differenzierung irreversibel. Das Protein schaltet dann die Expression der Sporulationsgene an und es kommt zur Sporenbildung. (Unden, 2014; Fritsche, 2012)

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12 2.1.4.2 Bildung

Die genaue morphologische Differenzierung ist in acht Entwicklungsstufen (0-VII) eingeteilt. (Unden, 2014) (Siehe Abbildung 1)

Abbildung 1: Morphologische Veränderungen während der Sporulation von 0-VII (Unden, 2014)

Der gesamte Prozess kann etwa 7 bis 8 Stunden dauern. Zu Beginn kommt es zu einem Proteinturnover. Es werden bestimmte Eiweiße abgebaut und Proteine neu synthetisiert. Das Chromosom wird repliziert. (0) Zudem erfolgt eine Kernteilung, allerdings ohne anschließende Zellteilung. Es findet eine asymmetrische Abschnürung eines kleinen Teils des Cytoplasmas mit einem Kernäquivalent statt, auch Sporenprotoplast genannt, woraus sich die letztendliche Endospore in der Sporenmutterzelle entwickelt. (I) Dabei verteilt sich jeweils eine Kopie der DNA auf die entstandenen Protoplasten. (II) Im Anschluss umwächst die Cytoplasmamembran der Mutterzelle die Vorspore. Sie ist dann insgesamt von drei Membranen umgeben: einer Cytoplasmamembran des Sporenprotoplasten und zwei Cytoplasmamembranen der Sporenmutterzelle. (III) Aus diesen Membranen werden die Sporenwandschichten gebildet. Die Sporenzellwand, auch Core genannt, entsteht aus der Vorsporenmembran. Zudem wird durch Anlagerung von mehreren Schichten dicht vernetzter Peptidoglykane die Sporenrinde oder Cortex von der Sporenmutterzelle nach innen synthetisiert. (IV) Der Vernetzungsgrad und die chemische Zusammensetzung des Peptidoglykangerüsts ist dabei unterschiedlich dem von vegetativen Zellen. Daraufhin beginnt die Dehydrierung. In der V. Phase folgt die Bildung der

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Sporenhülle bzw. Coat, die überwiegend aus Polypeptiden besteht. Ein locker anliegendes Exosporum wird allerdings bei Alicyclobacillus acidoterrestris nicht gebildet. (VI) Abschließend erfolgt die Autolyse der Sporenmutterzelle und somit die Freisetzung der Endospore. (VII) (Fritsche, 2002; Unden, 2014) Diese ist elliptisch und etwa 1,5 bis 1,8 μm lang und 0,9 bis 1,0 μm breit. (Yokota et al., 2007; Clotteau, 2014)

Dieser Prozess wird durch räumlich und zeitlich getrennt arbeitende Zweikomponenten-systeme, sowie spezifische σ-Faktoren und Anti-σ-Faktoren reguliert. Durch die unterschiedliche Größe der beiden Kompartimente (Sporenmutterzelle und Vorspore) entstehen Konzentrationseffekte. Zudem kommt es durch die zu Beginn asymmetrisch vorliegenden chromosomalen Gene zwischen Vorspore und Mutterzelle zu Synthesen der unterschiedlichen Faktoren σE, σK, σF und σG und damit zum Start von Expressions- und

Differenzierungsprogrammen. Während der Anti-σF-Faktor in der Vorspore beispielsweise

nicht synthetisiert wird, ist das in der Mutterzelle in zwei Loci (Genorten) der Fall. Dadurch findet das σF-abhängige Differenzierungsprogramm in der Vorspore statt. In der Mutterzelle ist

es hingegen inaktiviert. Durch die einzelnen σ-Faktoren werden der Reihe nach die Expression weiterer Transkriptionsfaktoren reguliert, wodurch kompartimentsspezifische Proteine gebildet werden. Die Richtigkeit der zeitlichen Abfolge wird dabei durch einen Austausch von Signalen zwischen der Vorspore und der Mutterzelle durch die Membranen gewährleistet. In der Mutterzelle kommt es durch den σE-Faktor zum Umwachsen der Spore, zur Bildung der Cortex

und der Hülle. σK-Faktor hingegen leitet die Phase IV und V in der Mutterzelle ein. Die σF und

σG-Faktoren spielen, wie bereits erwähnt, in der Vorspore eine Rolle. Sie sorgen für den Beginn

der II. Stufe (σF) bzw. der III. Phase, der Konservierung der DNA und die Vorbereitung der

Keimung (σG). (Unden, 2014)

2.1.4.3 Auskeimung

Die Auskeimung der Sporen erfolgt unter günstigen Umweltbedingungen. Frisch ausgebildete Sporen sind dazu nicht in der Lage. Sie müssen eine Ruhephase einlegen, die jedoch durch einen Hitzeschock wie ein Aufkochen oder mehrere Stunden Erwärmung bei 60 °C umgangen werden kann. (Fritsche, 2002) Dabei kommt es zur Ausscheidung der Dipicolinsäure und zur Freisetzung von Kationen. Es wird Wasser aufgenommen. Dadurch erfolgt der hydrolytische Abbau der Cortex. Zudem dehnt sich die Zellwand wieder aus und es kommt zu einer Stoffwechselumschaltung. (Schneider, 2014) Die zuvor katalytisch inaktiven Enzyme des Primärstoffwechsels werden reaktiviert. Außerdem erfolgen die Bildung von ATP und NADH aus gespeicherten niedermolekularen Substanzen durch den Katabolismus und der Abbau von

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Reserveproteinen durch Proteasen. Überdies entstehen während des Auswachens Proteine, die spezifisch für diese Phase sind und vermutlich eine regulierende Funktion haben. (Fritsche, 2002) Schließlich werden auch RNA und DNA synthetisiert. Die keimende, vegetative Zelle befreit sich von der Sporenhülle und beginnt wieder mit der Zellteilung. (Fritsche, 2002; Schneider, 2014)

2.1.4.4 Resistenz

Die Endosporen sind laut Cypionka (2010) in der Lage, kurzfristige Erhitzungen von 80 °C, wie sie bei einer Pasteurisation vorkommen, zu überstehen. Nach Fritsche (2002) vertragen sie aber auch stundenlanges Kochen, jahrzehntelange Trockenheit und die Einwirkung von aggressiven Chemikalien. Zudem sind sie resistent gegen ionisierende Strahlung (Unden, 2014). Die Resistenz gegenüber Hitze liegt dabei vor allem an der Bildung von Dipicolinsäure. Sie ist eine Vorstufe des Dihydrodipicolinsäure, die bei der Lysinsynthese hervorgeht. Während der Synthese wird eine große Menge an Ca2+-Ionen aufgenommen, sodass die Dipicolinsäure

vermutlich als Calciumchelatkomplex vorliegt. Dieser Komplex befindet sich im Protoplasten und nimmt etwa 10-15 % der Sporentrockensubstanz ein. Die genaue Funktion ist allerdings noch nicht geklärt. (Fritsche, 2002) Die Hitzeresistenz geht allerdings, wie in 2.1.2 schon erwähnt, auch von den enthaltenen ω-Cyclohexan-Fettsäuren aus. (Kannenberg et al., 1984) Zur Definition wie stark eine Sterilisation bzw. Hitzeresistenz ist, werden der D- und z-Wert verwendet. Der D-Wert stellt die Zeit dar, bei der nur noch ein Zehntel der Population zurück bleibt. Der z-Wert hingegen gibt den Betrag an, der bei der Temperatur erhöht werden muss, um den D-Wert auf ein Zehntel zu reduzieren, d.h. den Inaktivierungsgrad auf das Zehnfache zu erhöhen. (Keding, 1993) Je nach Stamm von Alicyclobacillus acidoterrestris kann die Hitzeresistenz laut Silva und Gibbs (2001) unterschiedlich ausfallen, sodass D95 °C-Werte in

Säften von 0,06 bis 5,3 min und z-Werte von 7,2 bis 12,9 °C entstehen. Andere Studien ermittelten zudem D90 °C-Werte von 16 bis 23 min. (Lee et al., 2002; Bevilacqua et al., 2008b)

Typische Bedingungen einer Pasteurisation (86 bis 96 °C für 15 s bis 2 min) von Säften werden dadurch überstanden. Die Sporen werden im Gegenteil sogar zum Auskeimen stimuliert. (Clotteau, 2014) Verschiedene Parameter können den Effekt der Sterilisation verstärken oder schwächen. Dazu zählen der pH-Wert, der Trockensubstanzgehalt, das umgebene Medium und vorhandene zweiwertige Kationen. (Tianli et al., 2014)

Vegetative Zellen werden hingegen bei einem pH-Wert von 4,0 bei einer 20-minütigen 80 °C Behandlung zu 99 % abgetötet. (Clotteau, 2014)

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15 2.1.5 Dekontaminationsverfahren

Es gab bisher vielfältige chemische und physikalische (oder auch beide in Kombination angewandt) Verfahren, die zur Inaktivierung von Alicyclobacillus acidoterrestris eingesetzt wurden. Dabei kann allerdings nicht gesagt werden, welches die effektivste Methode ist. Ein Vergleich der Wirksamkeit ist schwierig, da sowohl unterschiedliche Stämme, Medien als auch Versuchsbedingungen verwendet wurden. Teilweise waren selbst die Ergebnisse innerhalb einer Studie unterschiedlich. (Tianli et al., 2014)

Zur Inaktivierung des Bakteriums wurden unter anderem verschiedene Stoffe wie ätherische Öle, Bakterizide, Lysozyme, immobilisierte Silberionen, Chlordioxid, Ozon, Desinfektionsmittel, überkritisches CO2 und Säuren in Versuchen getestet. Zudem wurde mit

physikalischen Methoden wie Hochdruckhomogenisierung, hoher hydrostatischer Druck, Mikro- und Ultraschallwellen, Ohmsche Erwärmung, Gammastrahlung, UV-C Licht und thermischen Technologien experimentiert. (Tianli et al., 2014) Davon zeigten die angewandten Verfahren eine verschieden starke Wirkung auf den Mikroorganismus. Beispielsweise verlangsamten oder behinderten ätherische Öle wie Eugenol oder Zimtaldehyde die Sporenauskeimung. (Bevilaqua et al., 2008a) Nisin als Beispiel für ein Bakterizid verringerte bei einer Studie von Yamazaki et al. (2000) den D90 °C-Wert um 70 % und verhinderte das

Auskeimen von Sporen. Der Effekt in Apfelsäften war allerdings, wahrscheinlich durch die enthaltenen Phenole, stark eingeschränkt. Zudem sind die Kosten dieses Stoffs erhöht. Lysozyme in der Studie von Bevilaqua et al. (2014) zeigten bei einer Konzentration von 0,25 bis 1 g/l eine Inhibierung von 100 %. Beim Einsatz von Ozon kam es zur Inaktivierung von 3 Log-Stufen bei 28 mg/ml und 60 s und zur vollständigen Inhibierung bei 18 mg/ml und 90 s. (Qiu; Chen, 2004) Trotz der Effektivität mancher Zusätze sind sie nicht immer optimal für Lebensmittel geeignet. Beim Einsatz von Zusätzen muss auch auf die Verbraucherakzeptanz und die gesetzlichen Bestimmungen geachtet werden. (Tianli et al., 2014)

Bei den physikalischen Verfahren zeigte sich z.B. hoher hydrostatischer Druck (Silva et al., 2012) als effektiv für die Konservierung von empfindlichen Produkten. Bei deren Versuchen war eine Reduktion der Keimzahl um 2 bis 2,5 Log-Einheiten möglich. UV-Strahlung ist laut Baysal et al. (2013) in Grapefruitsaft sehr effektiv gewesen. Bei den Experimenten wurden je nach UV Dosis eine Minimierung um 3,5 bis 5,5 Log-Stufen erreicht, bei Apfelsaft hingegen nur 0,8 bis 2,2. Allerdings verursachen solche Verfahren höhere Anschaffungs- und Betriebskosten. Zudem besteht weiterer Forschungsbedarf. (Tianli et al., 2014)

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16 2.3 Kaltplasma im Lebensmittelbereich 2.3.1 Definition

Es wurden bisher drei Aggregatzustände (fest, flüssig und gasförmig) unterschieden. In der Physik definiert man „Plasma“ als vierten Zustand. Dieser entsteht, wenn durch viel Energie molekulare und atomare Strukturen eines Gases aufgebrochen werden und Elektronen und Ionen freigesetzt werden. (Niemira, 2012) Somit bezeichnet der Begriff „Plasma“ ein angeregtes Gasgemisch, das sowohl aus Neutralteilchen, Ionen, Elektronen, freien Radikalen als auch metastabilen Molekülen zusammengesetzt sein kann. Im Unterschied zu im Normalzustand befindlichen Gasen ist bei Plasma ein erhöhter Gehalt an Ladungsträgern vorherrschend. Dabei besteht nur selten ein gleich verteiltes Verhältnis von positiven und negativen Ladungen. In der Regel kommt es zur Bildung von stark fluktuierenden Ladungsüberschüssen und damit zu lokalen elektrischen Feldern. (Wintermantel; Ha, 2009) Die Entstehung und Zusammensetzung eines Plasmas ist dabei in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Entstehung und Zusammensetzung eines Plasmas (Beer et al, 2009)

Plasma kann dabei in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Eine Möglichkeit der Einteilung ist die nach der Art des Temperaturzustandes. Die Fachbegriffe dabei sind allerdings aufgrund der noch jungen Technologie unterschiedlich. Niemera (2012) unterscheidet in thermisches und nicht thermisches Plasma. Thermisches Plasma liegt bei mehreren 100 bzw. 1.000 Grad Celsius über der Raumtemperatur. Alle Teilchen sind extrem reaktiv. Die Energie ist ausreichend hoch, sodass sich alle Partikel im Gleichgewicht befinden und kein Energieaustausch zwischen ihnen erfolgt. Thermisches Plasma findet beispielsweise fürs Lichtbogenschweißen oder für Zündkerzen eine Anwendung. Beim nicht thermischen Plasma hingegen wird bei jedem Zusammenstoß von Elektronen Energie übertragen. Die verschiedenen Partikel behalten die verliehene Energie über eine gewisse Zeitspanne. Sie geben sie ab, wenn die Partikel miteinander wechselwirken. Das wird über visuelle und UV-Strahlung vollzogen. Die Menge an vermittelter Energie durch das Plasma ist dabei von der chemischen Zusammensetzung,

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Dichte und der Temperatur abhängig. (Niemera, 2012) Die Elektronen- und Gastemperatur weist dabei einen deutlichen Unterschied auf. Ersteres kann Temperaturen von mehreren 10.000 K annehmen, während die Gastemperatur sich weit darunter in der Nähe von Raumtemperatur befindet. Die mittlere kinetische Energie liegt dabei bei mehr als 1 eV, d.h. die Energiemenge eines Elektrons nimmt durch Beschleunigungsspannung zu (DFG, 2012). Anwendungsbeispiele für nicht thermische Plasmen sind dabei Leuchtstoffröhren oder Plasmabildschirme.

Zu der Kategorie des nicht thermischen Plasmas gehört auch das Kaltplasma. Es wird wie bereits erwähnt bei bzw. in der Nähe von Raumtemperatur erzeugt und ist deswegen auch für die Anwendung von hitzeempfindlichen Objekten wie z.B. Lebensmitteln geeignet. Allerdings muss beachtet werden, dass die aktiven Teilchen des Plasmas auch mit der Oberfläche des Lebensmittels reagieren können. Insbesondere können Auswirkungen auf die Farbe, Geschmack und Aroma entstehen. Bei Lebensmitteln, die leicht anfällig sind (wie Obst und Gemüse), muss die Bedeutung gegenüber der antimikrobiellen Wirkung abgewogen werden. (Niemira, 2012)

Es gibt viele Arten Kaltplasmen zu erzeugen. Dazu stehen unterschiedlichste Geräte mit verschiedenen Systemen zur Verfügung. Zum einen können die Geräte unter Atmosphärendruck oder Unterdruck arbeiten. Zum anderen kann die Energieart unterschieden werden. Das Plasmagerät wird entweder mit Elektrizität, Mikrowellen oder Laser betrieben. Als Gase werden einfache Moleküle wie Luft oder Stickstoff oder Gemische verschiedener Bestandteile wie z.B. inerte Gase Helium, Argon oder Neon in Kombination mit Sauerstoff o. ä. eingesetzt. (Niemira, 2012) Einen genaueren Einblick in die Möglichkeiten einer Plasmabehandlung zeigt Tabelle 1 auf.

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Tabelle 1: Technische Kenngrößen und Einflussparameter zur Beschreibung einer Plasmabehandlung (DFG, 2012)

Einzelsysteme Kategorie Beispiele für Parameter

Anlage

Kenngrößen Plasma

Art der Plasmaerzeugung Geometrie Spannung Strom Druck Gasgemisch Kenngrößen Applikator Kammervolumen Behandlungsdruck Kenngrößen Produkt Behandlungsfläche/ -volumen Behandlungsdosis Behandlungstemperatur Plasma

Strahlung spektrale Leistungsverteilung Geladene Teilchen Elektronendichte Ionenenergieverteilung Ionendichte Neutralteilchen Art Dichte Lebensdauer Reaktivität Temperatur

2.3.2 Einteilung nach der Positionierung des Lebensmittels

Kaltplasmageräte können nach Art ihrer Anordnung zum Lebensmittel in drei Gruppen eingeteilt werden: Entfernung zur Plasmaentstehung, relative Nähe zur Quelle und unmittelbar innerhalb der Erzeugung des Plasmas. Aufgrund dieser unterschiedlichen Positionierungen kommt es zu Differenzen in der Reaktivität und Wirksamkeit des Verfahrens basierend auf den zugrunde liegenden chemischen Eigenschaften der Gase.

Die erste Methode findet in der Praxis nur eine geringe Anwendung. Um das Lebensmittel zu behandeln, wird das Plasma zunächst erzeugt und auf das Produkt geleitet. Das kann entweder durch ein Transportgas oder seltener durch das Ausnutzen von Magnetfeldern geschehen. Das Lebensmittel und die Plasmaerzeugung sind separiert. Dadurch entsteht der Vorteil, dass Objekte mit unterschiedlicher Größe und Form behandelt werden können.

Die zweite Möglichkeit ist ein Kaltplasmasystem mit Direktbehandlung. Hierbei stellt die Vorrichtung aktives Plasma direkt zur Behandlung des Produkts bereit. Das Plasma wird dabei

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wie bei der ersten Methode mit Hilfe des Transportgases oder vergleichbaren Mitteln bewegt. Dieses System liefert allerdings höhere Konzentrationen an aktiven Teilchen. Der Grund dafür ist zum einen das dichter gelegene Ziel zur Generation des Plasmas. Zum anderen liegt es daran, dass das Plasma schneller in Kontakt gebracht wird, bevor die Teilchen wechselwirken und sie dadurch inaktiv werden. Zudem kann das System im Impulsbetrieb mit Frequenzen von über 100 bis mehreren 1.000 Hertz arbeiten. Ferner ist aufgrund von nur wenig bis nicht entscheidend normaler Atmosphäre zwischen der Generation und dem Zielbereich die Intensität der entstehenden UV-Strahlung auf die zu behandelnde Fläche relativ hoch. Insbesondere der aw-Wert und der Feuchtegehalt des Produkts spielen eine wichtige Rolle in Bezug auf die

Leitung der Elektrizität in einer ausreichend hohen Spannung. Allerdings kann die Elektrizität, wenn sie auf tierisches oder pflanzliches Gewebe geleitet wird, auch lokale Erhitzungen verursachen, die zu einem sensorischen Schaden wie angebrannte Stellen, Proteinkoagulation oder auch Veränderungen hinsichtlich Aroma, Textur oder Aussehen führen. Punktuelle Entladung konzentriert den Stromfluss, wodurch die Hitzeschäden entstehen. Deswegen muss die direkte Leitung durch das zu behandelnde Produkt möglichst verhindert werden. Das gelingt durch exakte Anpassung des Plasmageräts. Prinzipiell sind sie dadurch allerdings etwas schwieriger zu bauen als die Systeme mit weiter entfernt liegende Plasmaquellen. Je nach Bauweise des Emitters sind die Systeme flexibel in Bezug auf die Größe und Form des behandelnden Zielobjekts. Allerdings sind, wie bereits erwähnt, dem System Grenzen gesetzt. Nicht alle Produkte sind durch die elektrische Leitung für diese Art von Plasmaprozess geeignet.

Als dritte Bauart gibt es die Elektrodenkontaktsysteme, wo sich die zu sterilisierende Oberfläche zwischen den beiden Elektroden oder einer Elektrode und einem neutralen Grund befindet. Die Oberfläche liegt direkt im Feld der Kaltplasmaerzeugung. Hier besteht die höchst mögliche Intensität von Elektronen, Radikalen, Ionen und UV-Strahlung. Dadurch ist in diesem System die antimikrobielle Wirkung gegenüber des Produkts am größten. Allerdings muss hier sorgfältig die Form und der Aufbau der Elektroden zum Produkt überwacht werden, um punktuelle Entladungen und die damit verbundenen Hitzeansammlungen zu verhindern. Bei diesem System gibt es Einschränkungen in Bezug auf die zu behandelnden Lebensmittel. Es sind nur bestimmte Lebensmittelklassen für die Behandlung geeignet. Auch wenn gewisse Flexibilität durch die Verwendung von unterschiedlichen Gaszusammensetzungen und/oder dem Aufbau von einer oder beiden Elektroden besteht, sind aufgrund des eher geringen Raumes zwischen den Elektroden nur kleinere bzw. flachere Produkte für dieses System geeignet. Beispielsweise passen Nüsse, Beeren oder auch abgeflachte Lebensmittel wie Hühnerbrüste

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zwischen bzw. unter die Elektrode. Deswegen hat dieses System seine Grenzen in der technischen Bauweise. (Niemira, 2012)

2.3.3 Funktionsweise der Inaktivierung von Mikroorganismen

Bei der Anwendung von Plasma kommt es zur Reduzierung von Mikroorganismen. Der antimikrobielle Effekt tritt dabei primär auf den Oberflächen auf. (DFG, 2012) Die Mikroorganismen werden durch drei verschiedene Mechanismen inaktiviert. Es beruht zum einen auf der chemischen Interaktion der Radikale, reaktiven Teilchen oder geladenen Partikel wie Hydroxylradikale, Hydrogenperoxid, Ozon, Singulett-Sauerstoff und Superoxid mit der Zellwand der Organismen. (Niemira, 2012; DFG, 2012) Dabei kann die Elektronenenergie kovalente Bindungen in organischen Molekülen spalten. Die Energie, die für Einfachbindungen benötigt wird, liegt bei 1,5 bis 6,2 eV, bei Doppelbindungen bei 4,4 bis 7,4 eV und bei Dreifachbindungen bei 8,5 bis 11,2 eV. (DFG, 2012) Zum anderen beschädigt die auftretende UV-Strahlung (100 – 380 nm) die Membranen und die Zellbestandteile durch photochemische Reaktionen. Es kommt durch gebildete Radikale aus Sauerstoff und/oder Stickstoff zu Oxidations-, Spaltungs- oder Polymerisationsreaktionen. Außerdem werden die DNA Stränge teilweise zerstört. Die letztendliche (Letal-) Schädigung hat ihren Ursprung also in der Oxidation von Zellkomponenten, in der Akkumulation geladener Teilchen an der Zelloberfläche, im Absinken des pH-Werts mit Verlust der pH Regulation und im Zusammenbruch des Membranpotentials und der Energiegewinnung. Je nach Art des Produkts, Mikroorganismus und der Plasmamethode ist die Wirksamkeit der genannten Inaktivierungsmechanismen unterschiedlich. Bei atmosphärischen Plasma soll das Ätzen mit Radikalen die Hauptursache für die Inaktivierung sein. Der abtötende Effekt kann aber auch durch andere antimikrobielle Methoden verstärkt werden.(Niemira, 2012; DFG, 2012)

Die Effektivität der Plasmabehandlung hinsichtlich einer Inhibierung wird entscheidend von der Oberflächenstruktur beeinflusst. Poren, Kapillaröffnungen, ein hoher Wassergehalt und die Pufferkapazität werden als mögliche Einflussfaktoren betrachtet. Die Wirkung weicht deswegen von Lebensmitteloberfläche zu Lebensmitteloberfläche stark voneinander ab. Aufgrund dieser Tatsache lassen sich Experimente an Modellsystemen nur mit Einschränkungen auf andere komplexe Oberflächen anwenden. Ebenso nehmen produktspezifische Eigenschaften auf das Ergebnis einen Einfluss. Dazu gehören der spezifische Energieeintrag, die Produkterwärmung, die Temperaturverteilung, die Materialeigenschaften, die Zusammensetzung und die Geometrie. Zudem ist von Bedeutung,

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ob gleichmäßig geformte, stückige bzw. Schüttgüter oder Flüssigkeiten einer Behandlung unterzogen werden. (DFG, 2012)

2.3.4 Einfluss auf Lebensmittel

Bei der Plasmabehandlung wirkt das Plasma nicht nur auf die kontaminierenden Mikroorganismen, sondern auch in gleicher Weise auf die Lebensmittel bzw. die Lebensmitteloberflächen. Bei der Entkeimung sollte zwar eine größtmögliche Reduzierung der Mikroorganismen angestrebt, allerdings auch die Lebensmittelqualität nicht vernachlässigt werden. Einige Untersuchungen zeigten Veränderungen von bestimmten lebensmittelrelevanten Verbindungen auf. (DFG, 2012) Beispielsweise lag bei Feldsalat nach der Plasmabehandlung ein ungeklärt erhöhter Gehalt an Flavonoiden vor. (Grzegorzewski et al., 2010) Bei anderen Versuchen wurden Stoffverluste festgestellt. Aber auch die Veränderung von Pflanzenoberflächen durch Kaltplasma wurde beobachtet. Unter einem Rasterelektronenmikroskop zeigte sich eine veränderte obere Epidermis aufgrund von Erosionsphänomenen. Zudem kam es bei behandelten Spinatblättern, die anschließend gekühlt gelagert wurden, zu Verfärbungen. Zudem gab es z.B. Versuche, wie die von Reineke et al. (2013), die auf Gewürzen (Paprikapulver, gerebelter Oregano, ganzer schwarzer Pfeffer) zeigten, dass keine Veränderungen in der Produktfarbe zu sehen waren. Andere Sensorische Einschränkungen wurden bisher kaum untersucht. Der Einsatz von Plasma auf Lebensmitteln ist also noch umstritten. Es ist nicht auszuschließen, dass bei dieser Plasmabehandlung Stoffe entstehen, die gesundheitsschädlich oder ähnliches sind. (DFG, 2012)

2.3.5 Anwendung im Lebensmittelbereich

Industriell wird Kaltplasma schon länger in den verschiedensten Bereichen wie in der Medizintechnik, der Werkstoffherstellung oder auch Beleuchtungstechnik eingesetzt. Seit einigen Jahren wird auch auf dem Gebiet der Lebensmittelindustrie geforscht. Der Hauptteil von Untersuchungen bezog sich dabei überwiegend auf die Inaktivierung unerwünschter Mikroorganismen durch Kaltplasma bei hitzeempfindlichen Lebensmitteln. Das Kaltplasma fand dabei auf einige verschiedene Produkte und Mikroorganismen seine Anwendung. Die meist untersuchten Produkte sind stückige Lebensmittel. (DFG, 2012) Es wurden unter anderem Blaubeeren (Lacombe et al., 2015), ganzer schwarzer Pfeffer (Hertwig et al., 2015; Reineke et al., 2013) oder rotes Paprikapulver (Kim et al., 2014) direkt mit Plasma behandelt.

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Auch bei Flüssigkeiten wie z.B. Apfelsaft (Surowsky et al., 2014) konnte der Einsatz bisher stattfinden. Untersuchungen zu Weizenmehlen (Misra et al., 2015) fanden ebenfalls statt. Außerdem wurde der Einsatz von Kaltplasma bei Innenverpackungen von Tomaten (Misra et al., 2014a) und Erdbeeren (Misra et al., 2014b) untersucht. Das Plasma wurde auch zur Oberflächensterilisation bzw. –dekontamination von hitzeempfindlichen Gegenständen eingesetzt. Mehrere Studien, wie die von Wan et al. (2009) zeigten ein hohes Potential, Keime auf Trägermaterialien wie Glas, Papier und Kunststoffen zu hemmen bzw. abzutöten. Aber auch bei der Entkeimung von Metalloberflächen wie z.B. Werkzeuge in der Fleischverarbeitung wurde Plasma erfolgreich getestet. (Leipold et al., 2009)

Besonders interessant in dem Zusammenhang mit der Plasmaforschung in der Lebensmittelindustrie sind Endosporen-bildende Bakterien wie Clostridien und Bacillus Spezies. Sporen, wie die von Bacillus subtilis, waren der Mittelpunkt vielfältiger Untersuchungen. Sie sind aufgrund ihrer widerstandsfähigen Hüllschichten vergleichsweise resistent gegen herkömmliche Sterilisationsverfahren. Bei atmosphärischen Plasma waren für die Inaktivierung dieser Sporen hauptsächlich reaktive Teilchen von Bedeutung. Allerdings zeigte bei Experimenten mit einem geringen UV-Anteil eine unzureichende Inaktivierung, sodass die Parameter der Plasmabehandlung und die Zusammensetzung des Gases eine wichtige Rolle einnehmen. (DFG, 2012)

Ferner wurde dieses Gasgemisch gegen verschiedene Bakterien wie z.B. Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Listeria monocytogenes (Ziuzina et al., 2014), Bacillus atrophaeus (Patil et al., 2014), Geobacillus (Bokhorst-van de Veen et al., 2015) oder auch Citrobacter freundii (Surowsky et al., 2014) angewandt. Daten zu verschiedenen Lebensmitteln und deren Entkeimung liegen vor. Es sind Inaktivierungen bis zu 6, im Einzelfall bis zu 8 Log-Stufen möglich. Biofilme stellten allerdings eine größere Hürde dar. Sie zeigen eine besondere Widerstandsfähigkeit gegenüber atmosphärischem Plasma. (DFG, 2012; Niemira, 2012)

An sich stellt das Plasma dabei eine potenzielle Alternative für physikalische (z.B. ionisierende Bestrahlung, Hochdruck-, Hochspannungsimpulse) oder anderen chemischen (z.B. Chloreinsatz) Verfahren dar. Die Vorteile des Plasmas sind unter anderem eine hohe Wirksamkeit bei niedrigen Temperaturen, gezielte und verbrauchsgerechte Bereitstellung, geringe Beeinflussung der inneren Produktmatrix, wasser- bzw. lösemittel- und rückstandsfreie sowie ressourceneffiziente Anwendung. (DFG, 2012)

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23 2.4 Zitrusfrüchte

Der Begriff „Zitrusfrüchte“ ist definiert als eine Sammelbezeichnung für Früchte der Gattungen Citrus, Fortunella und x Citrofortunella. Dazu gehören unter anderem Orangen, Mandarinen, Grapefruits und Zitronen. Sie gehören zu den Rautengewächsen. (Liebster; Levin, 2002) Die Schale (Perikarp) der reifen Frucht besteht aus drei Schichten, dem Exo-, Meso- und Endokarp. Außen befindet sich das Exokarp. Es besteht aus einer wachsbedeckten Epidermis und schützt vor Austrocknung und Schädlingsbefall. (Liebelei; Reisdorff, 2007; Liebster; Levin, 2002) Darunter schließt sich das Mesokarp an. Es nimmt den größten Anteil der Schale ein und weist zwei Farbbereiche auf. Dazu gehören überwiegend das Flavedo und das Albedo. Das erste Gewebe ist durch Carotinoide gelb bis orange gefärbt und besitzt zahlreiche Ölbehälter, die mit artspezifischen ätherischen Ölen gefüllt sind. Das Albedo enthält große Interzelluren (gasgefüllte Hohlräume) und bildet ein relativ trocken, weißlich erscheinendes Schwammgewebe aus. Die letzte Schicht ist das Endokarp. Es umschließt mit seiner Haut die Fruchtfächer. (Liebelei; Reisdorff, 2007)

Zitrusfrüchte sind gegen zahlreiche Mikroorganismenarten recht widerstandsfähig. Große Schäden werden nur durch Schimmelpilze verursacht. (Müller; 1997) Deswegen findet nach der Ernte teilweise der Einsatz von Überzugsmitteln und Konservierungsstoffen statt. (Liebster; Levin, 2002)

Für den Verkauf werden die Früchte zur Entfernung von Staub, Rußtau und Rückstände von Pflanzenbehandlungsmittel häufig gewaschen und die Wachsschicht geht verloren. Um den Schutz vor Austrocknen und vorzeitigem Verderb wieder zu gewährleisten, erhält die Frucht einen künstlichen Wachsüberzug mit weißem oder gelben Bienen-, Candelilla-, Carnaubawachs, Schellack, Montansäureester, Polyethylenwachsoxidate oder Glycerinester aus Wurzelharz. Die Früchte besitzen einen stärkeren Glanz und leuchtendere Farbe als unbehandelte. Allerdings müssen diese Zusatzstoffe mit dem Hinweis „gewachst“ gekennzeichnet sein. Von der Kennzeichnung bis zu einer bestimmten Höchstmenge befreit sind der Einsatz von Zuckerestern von Speisefettsäuren und der Zuckerglyceride.

Zum Schutz vor Mikroorganismen werden außerdem verschiedene Konservierungsmittel eingesetzt, die fungizid wirken. Dazu zählen Thiabendazol, Orthophenylphenol und/oder Imazalil. (Liebster; Levin, 2002)

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24 3 Material und Methoden

3.1 Verwendete Mikroorganismen und Materialien

Für die Untersuchungen wurden folgende Materialien eingesetzt: - Alicyclobacillus acidoterrestris DSM. No.: 3922

- Hefeextrakt (Bacto Yeast Extract; DIFCO Laboratories) - Stärke (Sigma-Aldrich)

- Glucose (D(+)-Glucose wasserfrei; Roth) - Agar-Agar (Roth)

- Pepton (Kraemer & Martin GmbH) - Tween 80 (Roth)

- Chlorwasserstoff (1 M, Riedel-de Haën) - Äpfelsäure (Pulver)

- Natriumchlorid (Reinheit mind. 99,9 %, Appli Chem) - Plastikschale (etwa 20 x 12 cm)

- Papiertücher - Aluminiumfolie

- Malachitgrün-Oxalat (Roth) - Safraninlösung (Roth)

- Methylenblau (Ferak Laborat GmbH) - Aceton (Merck Schuchardt OHG)

- Plastik70 Schutzlack (CRC Industries Deutschland GmbH)

- Grapefruits (Kaufland, etwa 10 cm Ø, behandelt mit Orthophenylphenol, Thiabendazol und Imazalil, gewachst)

- Flächendesinfektionsreiniger (Konzentrat, Sokrena, Bode Chemie Hamburg)

Zudem wurden bei den Versuchen verschiedene Labormaterialien wie Petrischalen, Reagenzgläser und Erlenmeyerkolben unterschiedlicher Größe, Laborflaschen, Dionatwasser, Messkolben, Waagen, pH-Meter, Gasbrenner, Impfösen, Drigalski-Spatel und Ethanol, Drehtische, Pipetten mit verschieden großen Pipettiermengen und Auszählgerät verwendet.

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25 3.2 Geräte

- Plasmaquelle (Oberflächen DBE des Leibniz-Instituts für Plasmaforschung und Technologie e.V. Greifswald mit Spannungswandler, Elektroden und Kleinteilen)

- Zentrifuge (Sigma Laborzentrifuge GmbH 3K30, Rotor 12158-H & 12159-H) - Brutschrank (Heraeus Instruments Typ B 6200, 70°C)

- Brutschrank (Heraeus Instruments Typ B15, 50 °C) - Schüttler (Sartorius Stedim Biotech GmbH)

- Schüttler (Sartorius Certomat IS)

- Wasserbad (Gesellschaft für Labortechnik) - Mikroskop (Nicon Eclipse E400)

- Autoklav (UnityLab)

3.3 Vorbereitung der Versuche

Für die Versuche mussten unterschiedliche Medien wie Bouillons, Petrischalen mit Agar und Reagenzgläser vorbereitet werden.

Als Wachstumsmedien für den A. acidoterrestris wurden YSG-Bouillon bzw. YSG-Agar verwendet. Für die Bouillon wurden zu der festgelegten Menge Dionatwasser 0,2 % Hefeextrakt, 0,2 % Stärke und 0,1 % Glucose in einen Erlenmeyerkolben eingewogen, mit 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,7 eingestellt und anschließend bei 121 °C autoklaviert. Für die Herstellung des Agars wurden nur in die Hälfte des Anteils an destilliertes Wasser die entsprechenden Mengen an Nährstoffen übertragen. Die weitere Vorgehensweise geschah wie bei der Bouillon. In den anderen Anteil (500 ml) sind 15 g Agar-Agar eingewogen und mit einem Rührfisch verteilt worden, da es sonst zu einer starken Klumpenbildung im Nachhinein kam. (Goto et al., 2008) Diese so gefüllten Laborflaschen wurden ebenfalls autoklaviert. Im Anschluss daran wurden die Lösungen miteinander vermengt und jeweils etwa 25 ml (im 1.Versuch 20 ml) in Petrischalen gefüllt. Die Änderung wurde aufgrund von leichtem Austrocknen am Rand vorgenommen. Der K-Agar zum Vergleich des Wachstums wurde von der Technik her ebenso wie der YSG-Agar hergestellt. Als Nährbestandteile wurden allerdings 5 g/l Pepton, 2.5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Glucose und 1 g/l Tween 80 verwendet (Bevilacqua et al., 2008b). Zum Einstellen des pH-Werts wurde zudem 2,5 %ige Äpfelsäurelösung anstatt Salzsäure eingesetzt.

In die fertig autoklavierte YSG-Bouillon wurde der A. acidoterrestris mit Hilfe einer Impföse vom Ursprungsmedium übertragen. Der Erlenmeyerkolben wurde dann in eine Plastikschale gestellt, mit feuchten Papiertüchern umgeben und mit Aluminiumfolie umwickelt, damit die

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Mikroorganismenkultur nicht austrocknet. Anschließend wurde sie für 5 Tage bei 45 °C im Schüttler bei 140 U/min inkubiert.

In die Reagenzgläser für die Verdünnungsreihen wurden je 9 ml 0,85%ige Natriumchloridlösung gefüllt und ebenfalls autoklaviert.

3.4 Vorbereitung des Oberflächenplasmageräts

Bei dieser Plasmaanwendung handelt es sich um eine direkte Behandlung mit dielektrisch behinderten Entladungen (DBE). Das Plasmagerät arbeitet unter Atmosphärendruck und als Gasgemisch kommt Luft zum Einsatz. Das Gerät besteht dabei aus verschiedenen Elementen. Dazu gehören vor allem der Funktionsgenerator, die Hochspannungsversorgung, das Steuergerät, ein Spannungswandler, mehrere Elektroden zum Wechseln mit einem Glasdeckel mit drei Bohrungen und ein Verbindungskabel, welches zwischen dem Funktionsgenerator und dem Steuergerät gesteckt wird. Diese Elemente wurden miteinander verbunden und auf dem Funktionsgenerator wurde eine Frequenz von etwa 611 mHz eingestellt. Bis auf den Funktionsgenerator befand sich alles unter einem Abzug. (Siehe Abbildung 3)

Abbildung 3: Verwendete Plasmaanlage in den Versuchen

Der Spannungswandler kann bis 50 kV erzeugen. Deswegen befand sich die Plasmaanlage auf elektrisch isoliertem Untergrund.

Die Elektrode wurde nach einem etwa 30-minütigen Einsatz gegen eine andere Elektrode ausgetauscht. Nach der Plasmabehandlung mussten die Elektroden neu vorbereitet werden. Dazu wurden sie zunächst von restlichen Lackbestandteilen gereinigt, indem sie jeweils einzeln in ein gläsernes Becherglas mit Aceton gelegt und nach ca. 3 min wieder entnommen wurden. Anschließend wurden sie in ein Styropor-Rack gestellt und mit dem Plastik70 Lack besprüht.

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Nach einer mindestens zweistündigen Trocknung konnten sie maximal 45 min verwendet werden, bevor sie mit dem Lack neu besprüht werden mussten.

3.5 Durchführung der Versuche 3.5.1 Vorversuche

Bei den Vorversuchen wurde geprüft, inwiefern der Mikroorganismus auf dem YSG-Medium und in den Inkubatoren wächst und wie er auf die Hitzebehandlung zur Sporenisolation und auf die Plasmaeinwirkung reagierte. Dazu wurden mehrere Untersuchungen vorgenommen. Zunächst wurde versucht, das optimale Temperatur- und Zeitverhältnis für die Inaktivierung der vegetativen Zellen zu finden. Laut Pettipher et al. (1997) war eine Anwendung von 80 °C und 10 min Länge am effektivsten. So wurden unterschiedliche Kombinationen von Temperaturen und Zeiten eingesetzt. Dazu wurde in sieben mit 9 ml NaCl-Lösung gefüllte Reagenzgläser jeweils 1 ml der gleichen Bakteriensuspension pipettiert. Jeweils eins wurde in ein Wasserbad bei folgenden Bedingungen gestellt: 80 °C für 10, 20 und 30 min, 85 °C für 5, 10 und 20 min und 90 °C für 5 und 10 min. Anschließend wurden Verdünnungsreihen von 10-2 bis 10-5 erstellt, auf Agarplatten ausgestrichen und für 2 Tage bei 45 °C inkubiert.

Zudem wurden mikroskopische Untersuchungen der Proben ohne Behandlung und 10-minütigen 80 °C Wasserbadanwendung unternommen, um zu überprüfen, inwiefern die vegetativen Zellen gehemmt bzw. die Sporen durch das Wasserbad aktiviert wurden. Dazu wurden unterschiedliche Färbemittel angesetzt, eine 5%ige Malachitgrün-, 1%ige Safranin- und 0,4%ige Methylenblaulösung. Dabei sollten bei der Malachitgrünfärbung insbesondere Sporen, mit der Safraninlösung die vegetativen Bakterien und mit Methylenblau einzelne Zellbestandteile sichtbar werden. Um den Mikroorganismus unter dem Mikroskop zu betrachten, wurden 7 μl der Bakteriensuspension und etwa 5 mm daneben 5 μl steriles Wasser auf einen Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen auf dem Objektträger verteilt, sodass auf der einen Seite des Trägers eine höhere Konzentration vorlag. Anschließend wurde dieser an der Luft getrocknet und mit der beschichteten Seite nach oben dreimal kurz durch eine Gasbrennerflamme gezogen. Für die Anfärbung wurde der Ausstrich mit einer großen Menge Methylenblau bedeckt. Nach anschließender Einwirkzeit von etwa 8 min und vorsichtiger Spülung mit Wasser konnte das Präparat nach Trocknung an der Luft mikroskopiert werden. Bei der Behandlung mit Malachitgrün wurde zunächst ähnlich vorgegangen. Die luftgetrocknete und hitzefixierte Probe wurde mit der Malachitgrünlösung überschichtet. Danach wurde sie über einer Gasbrennerflamme eingedampft, bis sich eine metallisch glänzende Farbschicht zeigte. Dabei war zu beachten, dass der Objektträger nur mehrmals kurz

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in die Flamme gehalten wurde. Nach der anschließenden 2 bis 3 minütiger Entfärbung unter fließendem Leitungswasser wurde das Präparat mit Safranin etwa 10 min gegengefärbt, um auch die vegetativen Zellen rot sichtbar zu machen. Danach folgten wieder eine Spülung mit Wasser und die Trocknung an der Luft, bevor die Probe unter dem Mikroskop betrachtet werden konnte. (Steffens, 2011)

Zur Überprüfung des Wachstums wurde von der 5 Tage inkubierten YSG-Bouillon eine Verdünnungsreihe bis 103 erstellt. Von der 103 Verdünnung wurden je 0,1 ml im

Oberflächenausstrichverfahren auf 4 YSG- und 4 K-Agarplatten übertragen. Im Anschluss wurde diese bei 80 °C ins Wasserbad gestellt und wie zuvor vorgegangen. Diese Proben wurden dann in den Inkubator für 1 bzw. 2 Tage bei 45 °C gelegt und im Anschluss ausgezählt und verglichen.

Um herauszufinden, ob die Agarplatten im Inkubator aufgrund der erhöhten Temperatur von 45 °C eingepackt werden müssen, wurde auch dazu ein Versuch durchgeführt. Dabei wurden drei unterschiedliche Methoden angewandt. Es kam ohne Verpackung, mit Aluminiumfolie aber ohne angefeuchtetes Papier und mit Aluminium und Papier mit 5 g Wasser zum Einsatz. Dazu wurden jeweils 4 Platten mit 0,1 ml einer 103 Verdünnung der konzentrierten

Bakteriensuspension belegt und dementsprechend eingepackt. Nach 2 Tagen wurden die Ergebnisse betrachtet und miteinander verglichen.

Zuletzt wurde die Auswirkung des Plasmas auf Alicyclobacillus acidoterrestris überprüft. Dazu wurden aus der fünf Tage inkubierten Probe je 2 ml entnommen und in eine zuvor 2,5 min plasmabehandelte Petrischale von 6 cm Durchmessern gegeben. Auf diese wirkte dann 5, 10 oder 30 min Plasma ein. Im Anschluss wurden je 1 ml entnommen, in ein Reagenzglas mit 9 ml 0,85%ige Natriumchloridlösung gefüllt und eine Verdünnungsreihe bis 10-6 erstellt. Jeweils

0,1 ml wurden dann im Oberflächenausstrichverfahren mit dem Drigalski-Spatel auf der Agarplatte verteilt. Die Verdünnungsreihe wurde bei 80 °C für 10 min ins Wasserbad gestellt und anschließend nach kurzem Abkühlen ebenfalls ausgestrichen. Im Anschluss wurden die bestrichenen Agarplatten mit leicht feuchten Papiertüchern und Aluminiumfolie eingewickelt, sodass allerdings noch ein wenig warme Luft ins Innere gelangt und in den Inkubator bei 45 °C für 2 Tage gegeben.

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3.5.2 Plasmabehandlung von A. a. in einer Flüssigkeit

Für die Behandlung von einer in Flüssigkeit vorliegender A. a. Kultur wurden mehrere Untersuchungen vorgenommen. Es wurden insgesamt 3 Experimente durchgeführt, die ähnlich den Vorversuchen waren. Es wurden fünf 60er Petrischalen jeweils 2,5 min mit Plasma behandelt und mit 2 ml der verbrauchten Kultur befüllt. Drei wurden dann für jeweils 30 min plasmabehandelt, die anderen zwei stellten Nullproben dar. Aus diesen wurden wieder jeweils 1 ml für eine Verdünnungsreihe bis 10-6 entnommen, im Oberflächenverfahren ausgestrichen,

bei 80 °C für 10 min behandelt und wieder auf Agarplatten gegeben. Diese Platten wurden in den Inkubator bei 45 °C gestellt und nach 2 Tagen ausgezählt.

3.5.3 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Kunststoffoberfläche (Petrischale)

Zudem wurden Untersuchungen durchgeführt, wo die Mikroorganismen nicht in einer Flüssigkeit während der Plasmabehandlung vorlagen, sondern getrocknet auf der Polystyroloberfläche einer 60er Petrischale.

Es fanden zunächst drei Versuche statt, wo überprüft worden ist, ob es einen Unterschied zwischen vor und nach der Plasmabehandlung aktivierten Sporen gibt. Dazu wurden die 25 ml des inkubierten YSG-Medium in ein Plastikröhrchen überführt und bei 8000 g bei einer Drehzahl von 9517 U/min im Rotor 12158-H für 10 min zentrifugiert. Dabei setzten sich die Mikroorganismen und andere feste Bestandteile am Boden ab. Der Überstand wurde abgekippt und das Gefäß mit 25 ml sterilem Dionatwasser aufgefüllt und wieder bei gleichen Parametern zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde 2-mal wiederholt, sodass die Alicyclobacillus acidoterrestris Zellen gewaschen vorlagen. Im Anschluss daran wurden zum Absatz etwa 20 ml steriles Dionatwasser gegeben. Davon wurden dann 1 ml für die Keimzahlbestimmung der Nullprobe der vegetativen Zellen und Sporen vor der Trocknung entnommen. Es wurde eine Verdünnungsreihe bis 10-6 erstellt und im Oberflächenausstrichverfahren wie bei den

Vorversuchen auf den Agar gebracht. Von einem anderen Anteil der 20 ml wurden je 2 ml in vier einzelne 60er Petrischale gegeben. Die Petrischalen sind zuvor 2,5 min mit Plasma behandelt worden, um die Flüssigkeitsverteilung besser zu gewährleisten. Weitere 9 ml wurden 10 min ins 80 °C Wasserbad gestellt und danach ebenfalls in die Petrischalen wie zuvor gefüllt. Bei 45 °C wurden diese etwa 1,5 h ohne Deckel in einem Inkubator ohne Schütteln getrocknet. Im Anschluss wurden die Proben mit 0, 5, 10 oder 30 min Plasma behandelt. Beim ersten Versuch fehlte die Nullprobe allerdings. Nach diesem Vorgang sind in die Petrischalen je 2 ml 0,85%ige Natriumchloridlösung gegeben und für mindestens 1 h geschüttelt worden. Aus den

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Schalen wurden dann je 1 ml entnommen, in ein Reagenzglas mit 9 ml übertragen, eine Verdünnungsreihe erstellt und auf Agarplatten ausgestrichen wie zuvor beschrieben. Die Reihe, die zuvor aus der Flüssigkeit ohne 80 °C Behandlung erstellt worden ist, wurde zudem auch noch ins Wasserbad bei 80 °C für 10 min gestellt und anschließend nach kurzer Wartezeit ausgestrichen, um auch die Sporenbestimmung nach der Plasmabehandlung vornehmen zu können.

In weiteren Experimente wurde versucht, die Keimzahl zu erhöhen und die Wirkungsweise des Plasmas in kürzerer Zeit zu bestimmen. Dazu fanden zwei Versuche statt. Es wurden anstelle der 25 ml 75 ml YSG-Bouillon verwendet. Diese wurde in drei sterile Plastikröhrchen a 25 ml gefüllt, einmal bei den oben genannten Parametern zentrifugiert, mit je 25 ml sterilem Dionatwasser aufgefüllt und anschließend in der Zentrifuge dreimal gewaschen. Im Anschluss wurden in zwei Gefäße jeweils 5 ml gefüllt, der Absatz aufgeschüttelt, in das dritte Gefäß übertragen und mit 3,5 ml wiederholt. Dieses Behältnis wurde dann ebenfalls geschüttelt bis die Bestandteile in die Lösung übergingen. So lagen 17 ml der Bakteriensuspension vor. Es wurde die Nullprobe vor der Trocknung entnommen, vier 60er Petrischalen 2,5 min mit Plasma behandelt und mit je 2 ml Bakterienlösung gefüllt. Diese wurden wie zuvor getrocknet. Die Petrischalen mit den belegten Bakterien wurden mit 0, 1, 2 und 5 min Plasma behandelt. Im Anschluss sind dann je 2 ml Natriumchloridlösung zugegeben und über 1 h bei 100 U/m geschüttelt worden. Daraufhin wurde eine Verdünnungsreihe bis 10-5 für die Bestimmung der

vegetativen Zellen erstellt, die Proben auf YSG-Agar ausgestrichen, mit 80 °C behandelt und erneut auf Agarplatten gebracht, die dann nach 2 Tagen Inkubationszeit bei 45 °C ausgezählt wurden.

Zudem wurde eine noch höhere Aufkonzentration der Mikroorganismen aus der Bakterienkultur vorgenommen. Für diese insgesamt 6 Versuche wurden jeweils 450 ml YSG-Bouillon angesetzt. Nach der 120 h Bebrütung bei 45 °C im schüttelnden Inkubator wurde das Medium mit den Bakterien insgesamt viermal zentrifugiert. Dazu wurde das Medium in 6 größere Zentrifugengefäße a 75 ml gefüllt und im Rotor 12159-H bei 8000 g mit einer Drehzahl von 8544 U/min für 10 min zentrifugiert. Nach diesem Durchgang wurde der Überstand abgegossen und die Flaschen jeweils mit 15 ml sterilem Dionatwasser aufgefüllt. Anschließend wurden sie im Reagenzglasschüttler für 10 s gehalten, um den Absatz wieder in Flüssigkeit zu bringen und in kleinere Zentrifugengefäße a 25 ml überführt. Weitere 10 ml sind jeweils zum Ausspülen der größeren Behälter verwendet und ebenfalls in die Gefäße gegeben worden. Daraufhin wurden die Behältnisse in den kleineren Rotor 12158 gestellt und bei 8000 g mit einer Drehzahl von 9517 U/min zentrifugiert. Dieser Prozess wurde anschließend wiederholt.

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Am Ende wurden allerdings nur 3 Gefäße genutzt, sodass im vierten Zentrifugierprozess insgesamt nur 75 ml steriles Deionatwasser verwendet wurde. Für den letzten Schritt wurden in zwei der Plastikröhrchen 5 ml pipettiert, geschüttelt bis sich der Absatz löste, in das dritte überführt und mit je 1 ml nachgespült. So standen für die Untersuchung insgesamt 17 ml zur Verfügung. Bei den ersten drei Versuchen wurden jeweils 2 ml der Bakteriensuspension in eine 60er Petrischale gegeben und anschließend im Inkubator bei 45 °C bei geöffnetem Deckel über mindestens 1 h bis maximal 2 h getrocknet. Je nach Position im Inkubator fand die Trocknung unterschiedlich schnell statt, deswegen entstanden Zeitunterschiede. Bei den anderen drei Versuchen wurde hingegen ein Schüttler eingesetzt, der die Proben allerdings ebenfalls bei 45 °C trocknete. Dabei wurden die Proben kurz 10 min angetrocknet, dann erst 10 min bei 50 U/min und anschließend etwa 45 bis 60 min bei 100 U/min geschüttelt. Im Anschluss wurden die Petrischalen mit den aufgetragenen Bakterien für 0, 1, 2, 5, 10, 20 oder 30 min plasmabehandelt. Nach diesem Vorgang erhielten sie jeweils 2 ml 0,85%ige NaCl-Lösung und wurden 1 h bei 100 U/min bzw. bei den letzten Versuchen bei einer höheren Drehzahl von 140 U/min geschüttelt, damit auch der mittlere Bereich mit den belegten Bakterien wieder in Lösung geht. Wie bei den anderen Versuchen auch wurden dann Verdünnungsreihen erstellt, die Proben auf YSG-Agarplatten ausgestrichen und für 2 Tage bei 45 °C inkubiert.

3.5.4 Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale

Für die Versuche, Grapefruitschalen mit Plasma zu behandeln, musste zunächst herausgefunden werden, ob sich auf der Oberfläche der Grapefruit Fremdkeime insbesondere der Art Alicyclobacillus befinden, die später die Berechnungen verfälschen könnten. Dazu wurden zwei verschiedene Methoden angewandt. Zum einen wurde ein 9 cm2 großes Stück

Grapefruitschale mit einem vorher in NaCl getauchten Tupfer abgestrichen und diesen dann für 15 min in die NaCl-Lösung gegeben, zum anderen die gleiche Fläche mit 1 ml NaCl über einer Schale abgespült. Aus diesen wurden dann Verdünnungsreihen erstellt, auf YSG-Agarplatten übertragen, bei 42 °C inkubiert und über eine Dauer von 7 Tagen auf Mikroorganismen kontrolliert.

Für die eigentlichen Versuche wurde die Grapefruit zunächst unter lauwarmen Wasser gewaschen. Anschließend wurde sie trotz des negativen Ergebnis auf Keime mit 2,5%ige Oberflächendesinfektionsmittellösung eingesprüht und dieses etwa 20 s einwirken lassen. Daraufhin wurden auf der Grapefruit-Oberfläche möglichst ebene Flächen herausgesucht und insgesamt sieben 3 mal 3 cm große Stücke mit einem Messer herausgeschnitten. Diese Teile

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waren etwa 4 bis 7 mm hoch, was für die Behandlung unter der Elektrode zu dick war. Es wurde versucht, möglichst den Großteil des Mesokarps zu entfernen und so eine Dicke von etwa 2 bis 3 mm zu erreichen. Diese zugeschnittenen Quadrate wurden jeweils in eine 60er Petrischale gelegt und vorsichtig etwas platt gedrückt. Auf diese sind dann im ersten Versuch 0,5 ml und in den anderen drei Versuchen 0,3 ml der Bakteriensuspension, die wie im Versuch vorher hergestellt worden ist, geträufelt und sachte über die Oberfläche wurde, ohne dass an den Seiten die Flüssigkeit herunterrann. Die Petrischalen mit den belegten Grapefruitschalenstücken wurden für 25 min in den Inkubator bei 45 °C zum Trocknen gestellt, bis auf der Oberfläche eine leichte Schicht erkennbar wurde. Die einzelnen Stücke wurden 0, 1, 2, 5, 10, 20 oder 30 min mit Plasma behandelt. Anschließend wurden die Stücke mit einer Pinzette senkrecht über der Petrischale festgehalten. Die Grapefruitstücke wurden dann mit 3 ml NaCl-Lösung abgespült, umgedreht in die Petrischale zurückgelegt und etwa 1 h bei 100 U/min in den Schüttler gelegt. Nach dieser Zeitspanne wurden Verdünnungsreihen erstellt, auf YSG-Agar per Oberflächenausstrichverfahren aufgetragen und für 2 Tage bei 45 °C inkubiert.

3.5.5 Vergleich der Plasmabehandlung von A. a. auf einer Grapefruitschale mit der Behandlung mit UV-Strahlen

In diesen beiden Versuchen wurde untersucht, ob die bei der Plasmabehandlung entstehende UV-Strahlung für die Inaktivierung der Bakterien ursächlich ist. Dazu wurden, wie beim Experiment zuvor, die Quadrate der Grapefruitschalen entnommen und mit den Bakterien belegt. Zusätzlich zur ein- bzw. fünfminütigen Plasmabehandlung wurden die Schalen zum direkten Vergleich unter eine UV-Lampe, die 41 cm über den Proben war, für 0, 1, 5, 10, 20 und 30 min gelegt. Beim zweiten Versuch kam eine zweiminütige Verweildauer unter der UV-Lampe hinzu. Im Anschluss wurden die Proben wie sonst 1 h bei 100 U/min geschüttelt, in Verdünnungsreihen überführt, auf YSG-Agarplatten übertragen und bei 45 °C über 2 Tage inkubiert.

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33 3.5.6 Statistische Auswertung

Für die statistische Auswertung der Ergebnisse wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen bestimmt. Für die Bestimmung der signifikanten bzw. nicht signifikanten Unterschiede wurden dann zudem die Anova (engl. analysis of variance = Varianzanalyse) und der Tukey-Test durchgeführt. Als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde dabei p=0,05 für signifikant, p=0,01 für hoch signifikant und p=0,001 für höchst signifikant angenommen. Es entsteht eine Signifikanz, wenn der berechnetet F-Wert größer als der kritische F-Wert ist. Diese Berechnungen wurden in Excel mit Hilfe eines Add-Ins ausgeführt. Dabei gilt es aber zu beachten, dass nicht alle gleich durchgeführten Versuche auf diese Weise zusammen betrachtet werden konnten, da teilweise die Ausgangskeimzahlen unterschiedlich waren. Diesem konnte durch den Bezug der entsprechenden Keimzahl zur Nullprobe Abhilfe geschaffen werden:

ܳ ൌ ܭ݁݅݉ݖ݄݈ܽ݅݊ ܭܾܧ

݈݉ ݀݁ݎ݈ܲܽݏܾ݄݈݉ܽ݁ܽ݊݀ݑ݊݃ݐ כ ͳͲͲ ܭ݁݅݉ݖ݄݈ܽ݅݊ܭܾܧ݈݉ ݖݑݎܰݑ݈݈݌ݎ݋ܾ݁ݐ ൌ Ͳ

Das Ergebnis dieser Formel stellt die prozentuelle Menge dar, die nach der Behandlung noch vorhanden ist. Durch diese Formel konnten Experimente mit gleichen Versuchsparametern miteinander verglichen werden.

Bei den Auszählungen kam es auch vor, dass kein Keim auf den Agarplatten wuchs, sodass diese Proben mit „<10“, d.h. kleiner 10, gekennzeichnet wurden. Bei den Berechnungen wurden diese als 10 angenommen, um diese Werte verwenden zu können.

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34 4 Ergebnisse

4.1 Vorversuche

Bei den Vorversuchen stellten sich einige eher unerwartete Ergebnisse heraus.

Das Nährmedium, wo der Keim über die fünf Tage angezüchtet worden war, änderte sowohl die Farbe als auch den Geruch. Als das Bakterium hineingegeben wurde, war das Medium orange und hatte den typischen Hefeextraktgeruch. Nach drei Tagen nahm die Flüssigkeit eine gelbe bis hellorange Farbe an. Zum fünften Tag hin veränderte es sich zu blassgelb und einem unangenehmen Geruch. (Siehe Abbildung 10 im Anhang) Daran konnte man das Wachstum des Keimes erkennen. Vermutlich stellte die geruchsbildende Komponente Guajakol dar. Ursprünglich war es vorgesehen, nach einem Tag die Platten auszuzählen. Die Kolonien waren allerdings nach 24 h sehr klein, sodass die Zeit auf 2 Tage verlängert wurde. Zudem zeigte sich, dass in die Petrischalen zu wenig YSG-Agar gegossen worden war. Sie waren an den Rändern leicht eingetrocknet. Daraufhin wurde die Menge Agar auf etwa 25 ml erhöht. Das wurde in den nächsten Versuchen explizit beachtet.

Für die Inaktivierung der vegetativen Zellen, also um die Sporen beim Wachstum separat sichtbar zu machen, wurden unterschiedliche Temperaturen und Verweildauer im Wasserbad gewählt. Es stellte sich heraus, dass eine Temperatur von 80 °C und 10 min Dauer am besten dafür geeignet sind. Nach diesem Einfluss waren noch 2,4∙105 KbE/ml vorhanden. Die

Ursprungskeimzahl der Lösung ohne Behandlung lag pro ml bei 5,9∙105 KbE. Es fand etwa eine

Halbierung der Keimzahl statt. Bei einer Temperatur von 90 °C und 5 min Verweildauer waren nur noch sehr wenige bzw. bei 10 min gar keine Bakterien vorhanden. Bei 85 °C und 5 min Behandlung waren zwar mehr Keime (4,2∙105 KbE/ml) gezählt worden, allerdings ist hier

davon auszugehen, dass auch noch vegetative Zellen darunter waren. (Siehe Tabelle 2 im Anhang) Um das zu überprüfen, wurden einige Proben verschiedener Färbemethoden unter dem Mikroskop bei unterschiedlichen Vergrößerungen dazu betrachtet. Dabei kamen nicht sehr aussagekräftige Bilder heraus. Auf den Bildern ohne Hitzebehandlung, die mit Methylenblau angefärbt wurden, sind jeweils kleinere Ansammlungen oder Verklumpungen von stäbchenförmigen Bakterien zu erkennen. Auf den Bildern der 80 °C Hitzebehandlung hingegen einzeln verteilte Bakterien, vermutlich die gebildeten Sporen. Bei der Färbung mit Malachitgrün bzw. Safranin sind Unterschiede hinsichtlich der Form erkennbar gewesen. Bei den mikroskopischen Bildern der Probe, die die Hitzebehandlung erhielt, erkennt man nur viele einzelne eher rundliche Bakterien, beim anderen sowohl Stäbchen als auch rundliche Formen (Siehe Abbildungen 11 und 12 im Anhang). Die typische Farbgebung wurde allerdings nicht erkannt.

Abbildung

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Referenzen

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